四、可降低冷凍保存相關細胞延遲性死亡解決方案的探索

4.1 對冷凍保存細胞延遲性死亡中各種誘因的共同本源的分析

       冷凍保存相關的細胞延遲性死亡是一個內外因結合誘導的復雜過程，具有多屬性（物理性、化學性、器質性和功能性等）、多維度（基因表達、蛋白折疊、復合大分子的組裝等）、多靶點（各種細胞器、細胞膜和細胞間連接等）和多路徑（能力代謝，發(fā)育分化、增值和凋亡等）特點，其中有大量未解之謎。

       冰凍與解凍過程中冰晶形成與生長造成的機械損傷，是導致細胞活力喪失主因 ^[3] 。理由在于：

       1）細胞脫水：

       緩慢冷凍過程中，溫度低于平衡冰點后，細胞外水溶液形成冰晶，導致細胞外基質濃度升高。胞外滲透壓增加，引發(fā)脫水和收縮現象。過度脫水如不可逆，則會損害生物功能。

       2）冰晶損傷：

       無論是慢速冷凍還是快速冷凍過程中，生物材料解凍升溫至?15℃到?60℃范圍時，處于過冷狀態(tài)的細胞極易發(fā)生“冰晶再結晶”，即游離水轉化為冰晶，并隨著溫度升高冰晶體積增大，會造成細胞二次機械損傷，直接破壞細胞膜和細胞器。

       3）滲透脅迫：

       當溫度接近熔點時，大冰晶加速融化成水，胞外空間水溶液由高滲轉變?yōu)榈蜐B后，胞內高滲脅迫導致水分大量涌入細胞，引發(fā)細胞腫脹甚至破裂。

       4）氧化應激：

       在冷凍保存過程中，細胞脫水、高濃度電解質及pH值變化會，促進自由基的產生超氧自由基（O??）、過氧化氫（H₂O?）和羥基自由基（OH?）等ROS水平升高。而低溫削弱內源性抗氧化酶的活性。此外，冰晶破壞細胞膜和細胞器膜結構完整性，造成細胞內成分（如溶酶體酶）外滲，并引發(fā)二次氧化反應。而溫度驟變會誘導自由基生成，加劇氧化應激?？傊蚣毎x紊亂及多種酶促反應通路的激活，生成過量活性氧（ROS），通過脂質過氧化、蛋白質氧化和DNA損傷等方式導致細胞損傷。

       鮑斯特認為，冷凍后細胞壞死和凋亡過程，涉及細胞膜、細胞核和線粒體等眾多起始位點，與CPA影響到細胞、蛋白質組、基因組的結構有關 ^[45] 。而腎細胞、成纖維細胞、肝細胞、外周血單核細胞、臍帶血、精子、卵母細胞、卵巢組織等大量低溫暴露后出現壞死、死亡病理性反應的報道中，只是通過TUNEL實驗、流式細胞術等方法檢測到與細胞凋亡相關的指征，但誘發(fā)凋亡的應激源、發(fā)生過程并不清楚。既缺乏對細胞具體損傷部位微觀形態(tài)、生物化學、信號轉導通路等直接證據，也無受損具體基因組靶點、轉錄組學、蛋白組學層面異常探究結論。因此，冷凍保存相關細胞延遲性死亡，只能作為低溫損傷后果而非細胞致死原因。

       基于生物學常識，任何細胞膜、細胞器結構完整性受損，功能基因表達、蛋白翻譯后修飾及蛋白折疊、及生物分子之間相互作用的異常，都可能引發(fā)細胞功能的紊亂甚至死亡。冰晶在細胞內部三維空間恣意生長，受損細胞器豈止是已見報道的細胞膜、線粒體、細胞核？答案顯然是否定的。冰晶對細胞膜機械損傷破壞胞膜完整性，不同程度的氧化應激、滲透應激反應造成細胞結構功能損傷甚至細胞凋亡，的確可認定為因果關聯。目前，不僅滲透應激、氧化應激與細胞凋亡間確切聯系機制不明，應激反應初始誘因也未見提及。而這形同一面鏡子，既可讓你從中一窺生命科學前行的縮影，又能直面這一領域探索步履的蹣跚。

       如前所述，現有的小分子膜滲透型CPA分子，如DMSO，與水分子形成強大氫鍵，將改變體相水內部氫鍵網絡結構。CPA分子或分子簇通過水合作用形成溶劑化殼層，與胞內各組分、粒子的水合作用間存在自由水分子的競爭，影響胞內結合水-自由水的分配分布。

       DSMO利用自身雙性親和力，在胞內擴散后，可以直接與蛋白、脂質相互作用，造成生物大分子表面結合、內部疏水基團周圍的水分子解構，胞內區(qū)室局部組分出現脫水是完全可能。脫水波及范圍和程度則與CPA濃度有關?？紤]到不同細胞器生理功能不同，不同區(qū)室生物膜化學組成、膜流動性、膜蛋白組成差異，與CPA分子親和力有別，膜結構與功能對CPA干擾的耐受程度不同。CPA與細胞各生物活性組分間相互作用應是非特異性而廣泛的，而且具有細胞類型異、發(fā)育階段和功能活動狀態(tài)的異質性特點。

       CPA，特別是膜穿透型小分子CPA，憑借與水分子間形成的強大而穩(wěn)定的氫鍵網絡、水合作用競爭優(yōu)勢、與細胞組分相互作用的廣泛性，正好將整個胞內組分在冷凍保存期間發(fā)生的物理化學變化緊密連接。譬如：體相水粘度對DSMO濃度高度敏感性、CPA-水分子氫鍵結構，可以解釋胞內冰晶生成抑制效應；CPA與水的相互作用干擾到IDR結構域疏水作用后，造成細胞基因表達調控的紊亂；細胞與CPA分子相互作用，可造成膜的脫水、流動性、通透性改變，甚至引發(fā)膜穿孔，將造成線粒體、溶酶體、內質網、核糖體質膜損壞，氧自由基泄露，胞內生物大分子合成及代謝失常，可危及細胞一種或多種生物功能通路。

       法伊1990年就曾指出在，CPA與細胞內不同區(qū)域活性成分和功能結構的多重相互作用，干擾包括細胞酶促反應、膜轉運機制和離子交換等在內的生物過程，可引發(fā)細胞糖酵解能量生成缺陷、氧消耗異常以及電解質平衡紊亂而造成細胞損傷 ^[47] 。即使低劑量DMSO也可能誘導細胞凋亡和不受控的分化 ^[48] 。

       因此，站在物理化學角度，從CPA——水分子分布——細胞組分形態(tài)與功能三者間的內在聯系，來理解細胞冷凍過程死亡，似乎更為合理。

4.2 低溫生物學經典理論所指引的細胞冷凍保存死亡解決出路

       盧耶特提出的玻璃化技術，利用物理學的非晶態(tài)轉變原理將體相水中自由水分子的運動加以束縛，限制水分子間的聚集，實現對細胞內晶核和冰晶形成有效控制的目的。本質上，使用物理學降溫方法將水分子熱運動加以約束，阻礙水分子聚合結成冰晶。只要CCR夠高，樣品體積夠小，就可實現玻璃化轉變。細胞內部體相水脫水，在這并非首要條件。舍去細胞脫水環(huán)節(jié)的好處在于，胞內各生物膜、生物分子組分“各得其所(水)”，構型和功能活性得以保持，滲透壓應激也就無從談起。但玻璃化轉變對應的臨界冷卻速率（critical cooling rate, CCR)高達每秒數百攝氏度。已遠超Thermo CryoMed TSCM17SV、貝納吉CX17等液氮程序降溫儀（最高降溫速率99.9℃/min）及Grant CRFT等液氦斯特林制冷程控降溫儀（最高降溫速率10℃/min）的降溫速率極限。假設：1mL液體薄層采用液氦制冷，從4℃降至-269℃耗時僅1秒，則降溫速率為273℃/秒，幾近乎常規(guī)實驗條件下降溫技術能力極限。因此，靠單一物理降溫手段實現液體玻璃化理念，即便是當下，常規(guī)處理方法都難以有效施行。

       盧耶特的經典玻璃化理念給我們的啟示在于，少打細胞脫水的主意，多動腦筋綜合物理、化學手段，降低胞外溶液冰晶成核溫度，同時提升材料的玻璃化轉變溫度，縮小過冷溶液與玻璃化轉變溫差范圍，將有利于用液氮降溫處理快速完成玻璃化轉變，將水分子束縛，限制其自由積聚。

       馬祖爾中等冷卻速率方法中，通過在細胞保存液中添加適當鹽分提高溶液滲透壓后，細胞脫水而使體相水存量極大減少，內容物變得粘稠，水分子聚合受限，也就抑制了冰晶形成。低中等冷卻速率，可使護細胞免于高鹽與冰晶的暴露損害，實現細胞高存活率。在新一代革命性CPA制劑發(fā)明應用前，馬祖爾提出中間冷卻速率依然具有重要指導意義。

       不考慮細胞類型和細胞體積大小，盲目照搬細胞保存液配方和降溫速率條件，有可能造成保存失敗。據報道，傳統哺乳動物細胞儲存方法應用于非終末分化細胞經常被證明無效 ^[45] 。將緩慢冷凍或懸浮培養(yǎng)細胞團的玻璃化冷凍法用于人類胚胎干細胞（hES）冷凍保存，解凍后出現高比例細胞死亡及自發(fā)分化現象 [^49] 。傳統玻璃化保存方法中含10% DMSO配方保存液，對小鼠胚胎干細胞冷凍保存有效，但用于hESC存在細胞死亡率高、生長緩慢及分化過度等問題 ^[50] 。針對細胞胞膜、胞質、細胞器化學組分含量差異，優(yōu)化包括CPA在內的冷凍保存溶液配方，才是提高細胞的回收率和恢復率的正道。

       站在今天的角度看，由于細胞內容物蛋白等大分子含量高，較為粘稠，成核溫度較胞外溶液低。在細胞溶液中添加適量的非膜滲透型CPA制劑，提高溶液的粘稠度、降低溶液成核溫度，可減輕細胞滲透脫水程度。篩選可與膜雙層結構脂質分子、蛋白分子的弱相互作用，維持生物膜結構的穩(wěn)定性，保護生物膜，就可確保細胞內部生理環(huán)境相對穩(wěn)定。添加膜滲透型弱極性惰性粒子或小分子天然化合物，增加體相水粘度，增加胞內體系粘度以限制水分子運動，降低胞內體系成核溫度，同時不會對細胞組分產生毒性作用，采用液氮降溫法實現250μL-1.0mL體積細胞樣品無冰玻璃化冷凍保存，即可有效改善常規(guī)冷凍保存中細胞高死亡率問題。

4.3 通過功能性細胞保存溶液開發(fā)解決細胞延遲性死亡思路存在的弊端

       不同細胞類型出現冷凍保存后細胞延遲死亡，具有各自獨特生化通路特征。有學者指出，冷凍保存的生化干預方案應根據組織特異性，調控生化通路而非單純優(yōu)化冷凍保存流程，可提升生物材料解凍后的存活率 ^[6] 。通常，樣品保存材料除添加適量CPA中來控制冰晶形成之外，將包括自由基清除劑、離子螯合劑、蛋白酶抑制劑以及靶向細胞凋亡級聯反應的半胱天冬酶抑制劑和Rho激酶（ROCK）抑制劑等化合物添加到保存溶液或解凍后培養(yǎng)基中，被證明可減少人多能干細胞冷凍保存誘導的細胞凋亡 ^[51] 。譬如，在MDCK細胞的冷凍保存液中添加10μM單位的半胱天冬酶-1抑制劑V（Z-VAD-FMK)，顯示解凍后存活細胞比例提升10% ^[27] 。鑒于人類間充質干細胞（MSCs）冷凍保存過程中不僅激活了細胞內源性（線粒體）和外源性（死亡受體）信號通路，同時還觸發(fā)鈣蛋白酶級聯反應，故使用廣譜抑制劑Z-VAD-FMK比選采用擇性半胱天冬酶抑制劑處理細胞獲得更高細胞存活率 ^[52] 。

       hES作為“社會性”協同作用細胞，對細胞間隙連接及細胞間黏附接觸的任何損傷都十分敏感。連續(xù)傳代過程中若將hES集落解離為單個細胞或含<10個細胞簇，會嚴重損害體外hES存活與增殖。故所有培養(yǎng)方案中，都特別注意確保hES集落在連續(xù)傳代過程中被溫和解離成相對較大的細胞團塊。有證據表明，100個細胞大小的細胞團塊，最有利于hES集落生長擴增 ^[8] 。因此，傳統冷凍保存方法用常規(guī)慢凍-快融技術處理胰酶消化后的單細胞不適用于這類干細胞。但在冷凍培養(yǎng)基中添加ROCK抑制劑Y-27632，解離為較小細胞團塊（降低細胞團體積，提高降溫速度和均勻性）后冷凍保存后同樣可保持較高存活率，但無法提高克隆效率。如在解凍后培養(yǎng)基中也添加Y-27632，則可顯著促進hESC集落形成。研究還顯示，在冷凍解離前及解凍后兩個階段都加載Y-27632，可實現集落形成效率最大化，顯示出協調作用 ^[50] 。

       類似策略還可拓展到其他生物通路的調控領域。例如通過靶向應用抗氧化劑來降低氧化損傷。如傳統強效抗氧化劑褪黑素（Melatonin, MLT），新型有機化合物Ebselen（可模擬谷胱甘肽過氧化物酶的作用），SUL-10（通過保留線粒體網絡結構和激活線粒體復合物I和IV而維持ATP的產生并防止ROS的形成）以及軟骨組織中的抗壞血酸、硫酸軟骨素等特化細胞與組織的關鍵成分等。這些化合物可以直接添加到細胞培養(yǎng)基中用作細胞保存溶液，能保護細胞膜完整性 ^[48] 。

       甚至有人提出，一款成功的細胞冷凍保存溶液制劑的設計還應包括電解質（如Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Cl-，以抵消離子失衡），至少一種單糖（如葡萄糖，作為能量來源），低溫條件下有效的生物pH緩沖液（如HEPES）和有效的抗阻劑（如蔗糖或甘露醇）來抵消冷暴露期間細胞腫脹程度 ^[53] 。

       基于凋亡激活通路機制、生化通路不完整認識框架上，通過添加名目繁多的各種保護性功能制劑提高冷凍細胞存活率的途徑，是一條看不到盡頭的漫長征途。這種無休止地積木式做法，僅僅考慮了凍傷雙因素假說中的保存溶液溶質這一個方面，升級溶液配方的同時如不同步驗證、優(yōu)化降溫速率優(yōu)化，注定這類保存溶液所適用細胞類型的局限性，對于組織器官、類器官保存并無特殊優(yōu)勢。而日益復雜的制劑配方，不僅增加開發(fā)和質控成本，也給使用者帶來日益繁重的經費開支負擔。

4.4 創(chuàng)新CPA運用方案對減少冷凍保存有關細胞死亡的技術可行性

       細胞類型和細胞密度的多樣性以及組成細胞之間的形態(tài)尺寸差異，決定著組織和器官的獨特物理特性，進而影響樣品對冷凍和解凍的生物學反應。此外，組織中細胞-細胞和細胞-基質相互作用，也影響到冷凍后細胞存活率差 ^[3] 。

       在大體積組織、類器官或器官內部緊密的細胞間連接和三維結構，使CPA難以充分滲透進入組織的內部。生物組織導熱系數相對較低，受因熱傳遞和傳質限制，組織內極易出現溫度梯度差。組織外表與核心因溫差而造成收縮差異，而收縮引起應力會導致組織內部斷裂 ^[53] 。因此，對于類器官等大體積組織樣品，冷卻/解凍速率有其特殊意義。根據馬祖爾中等冷卻速度原則，無論何種類型細胞，要實現最佳回收率，從保存溶液配方、冷卻復蘇變溫速率兩個方面同時優(yōu)化至關重要。下面這兩則類器官保存案例便是明證。

1）人脂肪源間充質干細胞組織球體玻璃化冷凍保存方法 ^[54]

       研究目的：用人脂肪源間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC) ，經平衡液、玻璃化液兩步處理后用玻璃化保存方法，對單細胞MSC、三維MSC球體進行毒理觀測。

       平衡液CPA配方：以DPBS緩沖液為基礎，添加20%（體積比）胎牛血清、1.4M DMSO和EG；

       玻璃化液CPA配方：將LM5載體溶液中葡萄糖、甘露醇和乳糖替換為0.3 M蔗糖，添加2.8M DMSO、2.7M EG、2.8 M甲酰胺和70?g/L PVP K12而成；

       類器官三維球體生成方法：將第5代MSC接種于25μL懸滴法培養(yǎng)基中，每滴含104-105個細胞，用MSC培養(yǎng)基37℃、5% CO2濕潤環(huán)境中培養(yǎng)7天，用尼康倒置顯微鏡觀察MSC球體形成情況。

       類器官球體玻璃化處理流程：球體按10個/管的密度懸浮后轉移至1.5mL冷凍管，先在平衡液中懸浮10分鐘，再與玻璃化液混合1分鐘后，立即直接浸入液氮中保存?zhèn)溆?。兩周后將凍存管置?7℃水浴中快速解凍，解凍細胞依次用含20%胎牛血清的DPBS梯度緩沖溶液（含0.5M、0.25M和0M蔗糖）分別懸浮5分鐘后，轉入培養(yǎng)基進行正常培養(yǎng)。

       研究結果：使用高濃度的CPA對單細胞和球體進行玻璃化處理，經冷凍保存復溫后，類器官組織及單細胞存活率高，無細胞毒性。

2）人腎臟類器官玻璃化冷凍保存方法 ^[55]

       人腎單位祖細胞誘導分化人類多能干細胞（hPSC）構建的腎臟類器官的玻璃化冷凍保存研究實驗中，類器官樣本先經室溫下浸泡于平衡溶液中8-15分鐘后，立即轉移至含200μL玻璃化溶液的凍存管中處理10秒鐘。染色將凍存管立即浸入液氮中啟動玻璃化程序。最后所有類器官樣品管轉入-150℃深低溫冰箱儲存7天。

       平衡溶液CPA配方：10% DMSO和10% EG混合而成。

       玻璃化冷凍液CPA配方：含由20% DMSO、20% EG和0.75M蔗糖配制而成。

       三步升溫解凍復蘇液配方：類器官依次在含RPMI培養(yǎng)基配制的0.5 M蔗糖溶液（3分鐘）、0.25 M蔗糖溶液（3分鐘）、0.125 M蔗糖溶液（2分鐘）的微量管中孵育完成漸進式升溫過程。最后收集類器官，轉移至96孔板培養(yǎng)基中完成解凍后的培養(yǎng)階段中持續(xù)存活和生長。解凍7天后對類器官的存活率、功能性和結構完整性的評估。

       實驗結果：玻璃化冷凍技術存活率91%（接近照組達99.4%水平），類器官顯示出完整的近端和遠端小管，帶有 LTL 和 CDH1 細胞。簇狀足細胞結構的保存，表現出正常生長。

       上述兩例類器官保存案例中，用的都是玻璃化冷凍保存方法，在玻璃化保存溶劑中都采用了CPA組合的雞尾酒策略：平衡液中用低濃度DSMO+EG組合方案，玻璃化溶液中DSMO+EG兩種膜滲透型CPA的濃度翻倍，還添加了廉價的非膜滲透性CPA蔗糖，未添加抗氧化劑、抗凋亡試劑。

       除了將傳統CPA制劑組合運用外，毒性低、生物相容性好的新型化合物CPA的開發(fā)應用，是目前學界關注的研究熱點之一，《冷凍保護劑在細胞低溫保存技術中的應用》一文已有討論，此處不再贅述。

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