為了應(yīng)對(duì)極地、高原等常年低溫冰凍的環(huán)境，微生物、昆蟲、魚類和兩棲動(dòng)物等數(shù)十種物種，可長達(dá)數(shù)耐受詢價(jià)度以下低溫自然環(huán)境。如北極地區(qū)生活的地松鼠，體溫為-3℃情況下冬眠3周后后，身體各器官不會(huì)被凍傷。

       研究表明，多種耐凍物種的防凍關(guān)鍵策略之一是體內(nèi)合成大量低分子量碳水化合物，增肌胞內(nèi)粘性，同時(shí)穩(wěn)定胞膜的磷脂雙層，并限制胞內(nèi)冰晶形成。或這合成或防凍蛋白，結(jié)合于冰晶表面，防止更多水分子在聚集到冰晶表面聚集，阻斷冰晶成長 ^[1-2] 。

       冰凍與解凍過程中，因?yàn)榇罅勘Мa(chǎn)生引發(fā)機(jī)械損傷和氧化應(yīng)激效應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)與功能，是導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失的主要原因 ^[3] 。人們根據(jù)仿生學(xué)原理，在細(xì)胞低溫保存液中添加各種冷凍保護(hù)劑，可將生物材料（如細(xì)胞、組織、器官）冷卻至（?80℃至?196℃）低溫，以抑制甚至完全阻斷所有化學(xué)與生物反應(yīng)。在必要時(shí)解凍復(fù)溫后，生物樣品仍保持功能完整性和正常結(jié)構(gòu)。這種低溫冷凍保存生物樣本的方法，已在組織工程、遺傳發(fā)育、生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用和種質(zhì)資源保存等多種領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用 ^[2] 。

一、低溫保護(hù)劑抑制細(xì)胞內(nèi)冰晶的基本化學(xué)原理

       在組織細(xì)胞材料低溫保存時(shí)，通常會(huì)添加水溶性冷凍保護(hù)劑(Cryoprotectant or Cryoprotective agents, CPA)。CPA冷凍保存過程所發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制目前并未完全清晰，一般認(rèn)為可能與包括氫鍵調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜特性改變及增加溶液粘度等多重因素間協(xié)同作用有關(guān) ^[4] 。根據(jù)CPA穿透細(xì)胞膜能力的不同，大致分為細(xì)胞穿透型CPA、非細(xì)胞穿透型CPA兩種類型，二者在細(xì)胞保存液中具有不同理化性能和功能。

1.1 細(xì)胞穿透型CPA的水合效應(yīng)及防凍原理

       細(xì)胞穿透型CPA，如甘油（glycerol, GC）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、乙二醇（ethylene glycol, EG）、1,2-丙二醇（propylene glycol, PG）等，分子量低。細(xì)胞用含CPA滲透平衡溶液處理時(shí)，自由水通過胞膜擴(kuò)散滲出胞外，CPA則經(jīng)胞膜蛋白水通道進(jìn)入胞內(nèi)，補(bǔ)充了胞內(nèi)溶質(zhì)含量，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)外環(huán)境的滲透壓平衡，可避免細(xì)胞發(fā)生過度脫水。部分游離水將被CPA取代后，細(xì)胞內(nèi)的溶液粘度增加，自由水分子擴(kuò)散和聚集活動(dòng)遲滯 ^[2] 。進(jìn)入胞內(nèi)CPA分子與水分子通過氫鍵發(fā)生水合作用。，如DMSO的亞砜基（S=O）與水分子形成氫鍵的強(qiáng)更高（約30 KJ/M），而水分子間形成的氫鍵強(qiáng)度低（約20 KJ/M)，故DMSO與水間氫鍵壽命是水分子間氫鍵壽命的數(shù)倍 ^[5] 。CPA與水分子牢固結(jié)合，胞內(nèi)可用的游離水分子進(jìn)一步減少。CPA與水分子形成的氫鍵使很大一部分水分子被“鎖定”到無序構(gòu)型中，限制大量的水分子間通過氫鍵生成四面體結(jié)構(gòu) ^[6] 。生成Ih構(gòu)象冰晶所需的水分子聚合物無法大量供給，故抑制了晶核的形成和生長 ^[7] 。

       正常情況下，細(xì)胞質(zhì)中密布蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖聚合物、核酸等大分子及光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。又因自由水流失和CPA補(bǔ)充而變粘稠。當(dāng)樣本溫度降低至過冷狀態(tài)后，胞外溶液會(huì)首先形成冰晶。冰晶增長過程中，溶液中體相水體減少而出現(xiàn)溶液被濃縮和滲透壓升高。胞外滲透壓脅迫，誘使胞內(nèi)自由水再次外流，細(xì)胞因此再次發(fā)生脫水過程，胞體收縮。經(jīng)2次脫水后，胞質(zhì)被極大濃縮，大分子相互聚集，呈現(xiàn)“大分子擁擠”（macromolecular crowding）和細(xì)胞器堆積現(xiàn)象。胞質(zhì)由混懸液轉(zhuǎn)變成粘稠膠體。當(dāng)溶液溫度快速降至玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(glass‐transition temperature, Tg)以下時(shí)，粘稠膠體發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，胞內(nèi)體系呈現(xiàn)玻璃化固體網(wǎng)絡(luò)，水、離子、DMSO、代謝物等被分割限制在大量網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)中 ^[8] 。這些新形成的納米尺度胞內(nèi)孔隙造成自由水體積納米化，外加體系粘稠度極大，水?dāng)U散積聚停滯，正四面體結(jié)構(gòu)分子簇生成停頓，無法生成達(dá)到臨界晶核尺度，從而徹底阻斷了細(xì)胞內(nèi)部的冰晶成核過程。

1.2 非細(xì)胞穿透型CPA的防凍保護(hù)機(jī)制

       常用的非滲透性CPA，有小分子化合物蔗糖、海藻糖（非還原性雙糖）和高分子聚合物聚Ficoll（即聚蔗糖，由蔗糖和氯甲基環(huán)氧乙烷共聚合生成，富含羥基基團(tuán)，水溶性好，生物相容性優(yōu)良，常用作細(xì)胞器、細(xì)菌分離提取的密度梯度離心介質(zhì)）、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pyrrolidone, PVP)等。這類CPA，無法穿透細(xì)胞膜，對(duì)抑制胞內(nèi)冰晶生成作用不如DMSO有效。細(xì)胞冷凍保存液中添加非滲透性CPA，主要作用在于：

       1）增加細(xì)胞外溶液滲透壓，誘導(dǎo)胞內(nèi)水分滲出，與滲透性CPA協(xié)同，促進(jìn)細(xì)胞更快脫水。

       2）可作為增稠劑，有助于溶液膠體化和玻璃化轉(zhuǎn)變，提高體系玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，降低臨界降溫速率(critical cooling rate, CCR)，更外實(shí)現(xiàn)樣品體系的玻璃化轉(zhuǎn)變。還可降低臨界升溫速率(Critical warming rates, CWR)門檻，確?，F(xiàn)有復(fù)溫技術(shù)條件下快速完成復(fù)溫進(jìn)程，抑制溶液冰晶再結(jié)晶。

       3）細(xì)胞膜穩(wěn)定作用：在復(fù)蘇去除CPA過程中，因外部溶液低滲，水跨膜流入胞內(nèi)，以便將胞內(nèi)滲透性CPA置換出胞外，濃縮的細(xì)胞內(nèi)容物逐步恢復(fù)到初始等滲狀態(tài)。在缺少非滲透性CPA保護(hù)情況下，多輪的梯度溶液置換CPA操作，會(huì)因?yàn)榘麅?nèi)外滲透壓差增大，導(dǎo)致胞體膨脹，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整性喪失，甚至造成細(xì)胞死亡。而溶液中添加的非滲透性CPA，可在細(xì)胞表面形成粘性外殼，維持胞膜穩(wěn)定，防止胞體發(fā)生過度滲透性膨脹損害 ^[9] 。蔗糖用于精子和卵母細(xì)胞的冷凍保存早已被證實(shí)行之有效 ^[10] 。

1.3 防凍蛋白的防凍機(jī)理

       某些極地魚類、昆蟲和植物體內(nèi)可合成抗凍蛋白(Antifreeze proteins, AFP)。AFP能通過與冰晶核相互作用來抑制冰晶核形成和生長，從而降低了溶液的非平衡結(jié)冰溫度。這種使冰點(diǎn)低于熔點(diǎn)的特性，稱為熱滯活性(thermal hysteresis activity, THA)。因此，抗凍蛋白也叫熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白(Thermal Hys-teresis Proteins, THPs) ^[11] 。不同自然環(huán)境下形成的冰晶形態(tài)復(fù)雜，故進(jìn)化產(chǎn)生AFP的來源、序列和結(jié)構(gòu)的具有多樣性與復(fù)雜性。關(guān)于各種AFP抗凍作用機(jī)理，學(xué)界存在“成核抑制”、“吸附-抑制”、“受體-配體”模型及“錨定水合機(jī)制”(anchored clathrate water, ACW)等多種假說 ^[12] 。

       AFP能通過其表面的冰結(jié)合位點(diǎn)(Ice-binding site, IBS)與冰晶吸附結(jié)合，阻止冰晶通過小晶體融合和奧斯瓦爾德熟化過程（Ostwald ripening，是指發(fā)生在過飽和固溶體或液溶膠中較小顆粒逐漸溶解，而較大顆粒不斷長大導(dǎo)致顆粒平均尺寸增大的現(xiàn)象）繼續(xù)生長而保護(hù)生物免受冰凍傷害 ^[10] 。

       因AFP屬于異源蛋白，會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，加之生物合成成本問題，在動(dòng)物組織細(xì)胞保存中使用極少，故不作過多討論。

二、低溫保護(hù)劑在細(xì)胞冷凍保存過程毒性的基本認(rèn)識(shí)

       不同組織細(xì)胞的組分構(gòu)成相似，但因溫度、CPA濃度、暴露時(shí)長、載體溶液類型等實(shí)驗(yàn)條件不同，對(duì)CPA的毒性反應(yīng)有諸多差異。有學(xué)者指出，細(xì)胞膜破裂或受損、酶功能異常、細(xì)胞或胚胎發(fā)育受阻、精子活力下降、線粒體功能減弱，或DNA、蛋白質(zhì)等大分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，可視作衡量CPA細(xì)胞毒性的指征 ^[13] 。

       CPA毒性可以是某種CPA發(fā)生在特定使用條件下、特定的細(xì)胞或器官時(shí)所出現(xiàn)的特異性毒性反應(yīng)。譬如DMSO，是心臟保存中首選的CPA，但被公認(rèn)為具有廣泛的細(xì)胞毒性。在30℃條件下，當(dāng)DMSO濃度達(dá)到10%（v/v）（即1.41 M）時(shí)，大鼠心肌會(huì)出現(xiàn)不可逆的超微結(jié)構(gòu)改變。7.5%-10% （v/v）濃度梯度的DMSO暴露，可顯著降低外周血祖細(xì)胞的克隆形成能力。小鼠成纖維細(xì)胞在37℃條件下暴露于10% （v/v）濃度DMSO 1小時(shí)，觀察到細(xì)胞膜出現(xiàn)波動(dòng)但未發(fā)生腫脹；20%濃度引發(fā)細(xì)胞吸水膨脹；30%濃度則導(dǎo)致質(zhì)膜起泡，表明細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架發(fā)生解離。數(shù)據(jù)顯示，大鼠耳蝸細(xì)胞暴露于0.5%-6%濃度的DMSO 24小時(shí)后，其凋亡率呈現(xiàn)劑量依賴性上升趨勢。

       CPA毒性還可以是用于CPA時(shí)才出現(xiàn)的非特異性毒性。以丙二醇（PG）為例，當(dāng)作為常用的食品添加劑，不僅無明顯全身毒性作用，甚至還曾被用作乙二醇（EG）中毒的解毒劑。但當(dāng)作為CPA使用時(shí)，PG往往表現(xiàn)出毒性。有報(bào)道證實(shí)，PG濃度超過2.5 M時(shí)會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)pH值而損害小鼠受精卵的發(fā)育潛能。器官玻璃化技術(shù)概念的提出者、美國低溫生物學(xué)家格雷戈里·M·法希（Gregory M. Fahy)指出，CPA是通過干擾水分子之間的氫鍵作用來阻止胞內(nèi)冰晶形成的，因此，CPA的這種毒性效應(yīng)屬于非特異性毒性^[14] 。研究發(fā)現(xiàn)，DMSO能以濃度依賴方式調(diào)控生物膜通透性。5%（v/v）的低濃度DMSO會(huì)降低細(xì)胞膜厚度而增加其滲透性。常規(guī)使用的10%（v/v）濃度下，DMSO會(huì)誘導(dǎo)膜的水孔形成。當(dāng)DMSO濃度升高至40%（v/v）時(shí)，還會(huì)破壞磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞損傷或降低發(fā)育潛能。

       在玻璃化冷凍和解凍過程中，卵母細(xì)胞會(huì)面臨冰晶形成、冷凍保護(hù)劑（CPA）毒性、水分子及CPA分子穿越質(zhì)膜擴(kuò)散以及溫度波動(dòng)等多重挑戰(zhàn)，從而引發(fā)化學(xué)、機(jī)械、滲透和熱應(yīng)激損傷。隨后可能出現(xiàn)形態(tài)改變、卵丘細(xì)胞物理/功能脫離、染色體異常、線粒體功能與分布改變以及氧化應(yīng)激，這些因素都會(huì)限制卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍后的存活率和發(fā)育能力。因此，某些被歸因于CPA毒性的現(xiàn)象，實(shí)際上可能是滲透休克（osmotic shock）、氧化應(yīng)激（oxidative stress）損傷、冷休克（Cold Shock）、冷凍損傷（Chilling Injury）或其他損傷因素與CPA非特異性毒性交織作用所導(dǎo)致的 ^[13] 。

三、細(xì)胞冷凍保存中低溫保護(hù)劑應(yīng)用的新動(dòng)向

       DMSO和甘油這兩種常用的低分子量CPA，已被證實(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷、肝組織表觀遺傳改變、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化和臨床應(yīng)用安全問題。此外，部分細(xì)胞類型（如人類胚胎干細(xì)胞hESCs）在使用DMSO和甘油保存后，需經(jīng)多次淘洗才能從細(xì)胞中徹底清除，不僅耗時(shí)較長，且清洗步驟可能導(dǎo)致高達(dá)0%的細(xì)胞損失，回收率低。

       為克服傳統(tǒng)玻璃化冷凍技術(shù)中DMSO應(yīng)用局限性，科研人員已提出多種降低細(xì)胞保護(hù)劑（CPA）毒性的方法。如，通過優(yōu)化CPA的添加與去除操作來最大限度減少毒性，開發(fā)新型具有生物相容性、高轉(zhuǎn)染效率及快速釋放特性的細(xì)胞保護(hù)劑，以來替代或減少DMSO的用量，并解決多細(xì)胞系統(tǒng)和全器官冷凍等復(fù)雜樣本保存的難題 ^[4] 。

3.1 中性氨基酸類CPA的開發(fā)應(yīng)用

       多種中性氨基酸或其衍生物，如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和ε-氨基己酸等，可與水分子形成氫鍵，破壞水分子間的連接并抑制冰晶形成，減輕冰晶對(duì)細(xì)胞造成的滲透和機(jī)械損傷。這類化合物顯著提升了生物相容性與冷凍保護(hù)效果，同時(shí)將細(xì)胞毒性降至最低，有望實(shí)現(xiàn)無核及有核哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的高效冷凍保存 ^[15] 。

3.2 傳統(tǒng)CPA運(yùn)用方案的優(yōu)化

       CPA細(xì)胞毒性反應(yīng)與溫度、CPA濃度和滲透性和暴露時(shí)間有關(guān)。通常，高濃度、較高溫度下CPA被認(rèn)為毒性更強(qiáng)。濃度和溫度越高，CPA滲透得越快，細(xì)胞質(zhì)就會(huì)膨脹甚至膜破裂風(fēng)險(xiǎn)越高。在現(xiàn)有成熟技術(shù)基礎(chǔ)上，通過CPA間組合應(yīng)用，可降低單一種類CPA毒性。

(1) 滲透性CPA組合應(yīng)用

       一項(xiàng)CPA對(duì)豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：37℃溫度，相同終濃度（CPA 3M以內(nèi)）和暴露時(shí)間（120min以內(nèi)）條件下，PG毒性最強(qiáng)，DMSO和FMD毒性稍弱，EG和GLY毒性最低；所有雙CPA組合的毒性均低于單一CPA。3M濃度的EG-DMSO-GLY溶液能維持細(xì)胞膜完整性。類似研究表明，DMSO與PG聯(lián)合使用能有效降低兩種CPA毒性，提升細(xì)胞存活率。近年來，將傳統(tǒng)膜滲透型CPA組合成功運(yùn)用于類器官保存開始見諸報(bào)道。

       在腎臟類器官玻璃化保存技術(shù)研究中，脫水平衡液采用含谷氨酸的RPMI培養(yǎng)基，添加10% DMSO、10% 乙二醇的配制，玻璃化溶液則是含谷氨酸的RPMI培養(yǎng)基中添加20% DMSO，20%乙二醇和0.75M蔗糖制備。解凍后，腎臟類器官出正常生長，內(nèi)部個(gè)功能結(jié)構(gòu)和功能活力得以完好保持。這種方法還適用于腸道模型類器官的平衡-玻璃化-升溫解凍處理。

       操作基本步驟包括 ^[16]：

A- 用移液器提取四個(gè)類器官，轉(zhuǎn)移至Eppendorf 管中；

B- Eppendorf 管中含有200μL用以谷氨酸RPMI 培養(yǎng)基添加10% DMSO、10% 乙二醇的配制的平衡溶液；

C- 將類器官在室溫下浸入平衡溶液中為8-15分鐘，以便CPA充分滲透到腎臟類器官中；

D- 將類器官轉(zhuǎn)移到含有 200 μL玻璃化溶液的凍存管中；

E- 玻璃化溶液中DMSO、乙二醇的含量調(diào)整為20% DMSO、20% 乙二醇，類器官玻璃化液處理時(shí)間10秒；

F- 將凍存管直接暴露在液氮中 10 秒；

G- 將冷凍管轉(zhuǎn)移至-150℃深低溫冰箱中保存。

(2) 滲透與非滲透型CPA組合應(yīng)用

       海藻糖為可溶性、非還原性的葡萄糖二糖，能夠通過取代水分的方式為胞內(nèi)生物大分子提供保護(hù)性“水合”作用，有利于維持大分子活性結(jié)構(gòu)。蔗糖和海藻糖等還可在細(xì)胞表面形成粘性外殼來保護(hù)細(xì)胞膜。將非滲透型高分子量聚合物CPA與滲透型CPA或玻璃化方案結(jié)合使用，防止在解凍后去除CPA過程中細(xì)胞發(fā)生過度的滲透性膨脹 ^[9] 。低濃度海藻糖和DMSO聯(lián)合使用已成功冷凍保存小鼠卵母細(xì)胞 ^[17] 。玻璃化冷凍是臨床上首選的卵母細(xì)胞和胚胎冷凍保存方法，還可用于大容量儲(chǔ)存和全器官冷凍等緩慢冷凍不適用的場景。要實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍，需要使用高濃度的滲透性和非滲透性CPA，并配合快速冷卻速率以避免冰晶形成。通過1.5 M丙二醇和0.5 M海藻糖對(duì)直徑70μm的AML-12肝細(xì)胞液滴進(jìn)行玻璃化冷凍，解凍后存活率可達(dá)~90%，實(shí)現(xiàn)了低濃度CPA條件下的冷凍保存 ^[4] 。聚乙烯醇（PVA）等冰重結(jié)晶抑制劑（ice recrystallization inhibitors, IRI）是一種低分子量CPA，可進(jìn)入細(xì)胞，影響細(xì)胞內(nèi)冰重結(jié)晶的能力，減少凍融過程中的不可逆蛋白質(zhì)聚集。

(3) 大分子兩性聚合物與DMSO的組合

       當(dāng)前研究熱點(diǎn)是開發(fā)新型合成與天然聚合物，包括部分不具備特定冰晶結(jié)合或抑制冰晶重結(jié)晶活性的聚合物，以替代或減少有機(jī)溶劑用量，又提高解凍后的細(xì)胞存活率。分子同時(shí)包含混合陽離子和陰離子側(cè)鏈的聚合物，屬于兩性電解質(zhì)，可調(diào)控冰晶重結(jié)晶抑制，降低脂質(zhì)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）而發(fā)揮保護(hù)作用。盡管其活性強(qiáng)度與強(qiáng)效的IRI PVA相比活性較低，但在玻璃化冷凍和緩凍保存方案中表現(xiàn)優(yōu)于IRI類材料。在冷凍保存時(shí)同時(shí)使用聚兩性電解質(zhì)和DMSO時(shí)，解凍后的存活率較高。表明，聚兩性電解質(zhì)與滲透性CPA（如DMSO）之間存在協(xié)同作用。

       聚木甘露聚糖具有調(diào)控冰晶生長的作用，但其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系尚未明確。來自腸桿菌A47的富巖藻糖陰離子多糖FucoPol在濃度2.5mg/mL時(shí)即能使DMSO冷凍保存的細(xì)胞解凍后存活率提升70%。其確切作用機(jī)制尚不明確，對(duì)冰晶生長影響甚微，推測可能是通過降低溶液的過冷度而發(fā)揮作用 ^[4] 。

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