冷凍保存（cryopreservation）是指通過將經(jīng)過冷凍保護的活體細胞或完整組織、器官及生物體置于超低溫環(huán)境（通常為液氮或其蒸氣中，最低溫度可達-196℃）進行保存。其目的是通過樣本的冷卻有效抑制包括可致細胞死亡的生化反應在內所有生物活動 ^[1] 。常用的冷凍保存方式分為不可控或可編程受控速率緩慢冷卻保存法（Controlled-rate cooling）、玻璃化保存法（vitrification）兩種（見《玻璃化技術在生物樣本低溫保存中的應用原理及實施方法》）。

       在溫度低至-196℃環(huán)境下，樣品降解反應幾乎停止，可穩(wěn)定儲存長達幾個世紀 ^[2] 。國際生物與環(huán)境儲存庫學會（International Society for Biological and Environmental Repositories, ISBER）2012年頒布的《研究用生物材料收集、存儲、檢索和分發(fā)存儲庫最佳實踐》中將Mazur給出的水玻璃化轉變溫度(glass transition temperature of water, GTTW)，即-132℃，作為所有生物活性停止的臨界值。對樣品應儲存在液氮氣相（約-150℃）或液氮液相（約 -196℃）的選擇，推薦氣相儲存模式。不僅因液氮氣相溫度足以保持樣品溫度低于GTTW臨界值，還有避免液相儲存固有安全風險的考量。

       然而，實際工作和文獻報道中，在-80℃超低溫冰箱中儲存生物樣本的情況確實存在 ^[3-5] 。所以，有必要澄清，到底組織細胞能否在-80℃超低溫冰箱環(huán)境中長期穩(wěn)定儲存這一問題。

一、阿倫尼烏斯方程原理對低溫冷凍保存溫度制定的指導意義

       1889年，瑞典物理化學家，1903年諾貝爾化學獎獲得者S·A·阿倫尼烏斯(Svante August Arrhenius, 1859-1927)，基于電解質在水溶液中電離的大量實驗證據(jù)，得出化學反應速率常數(shù)與反應溫度之間的定量關系式——阿倫尼烏斯方程（Arrhenius Equation），以描述溫度（T）、活化能（Activation energy, Ea）與反應速率常數(shù)（k）間的關系。

K=Ae^((-Ea)/RT)  ………………………………………①

       公式①被稱二常數(shù)公式或二元線性回歸方程。低溫生物學關注的是常規(guī)室溫（+20℃~27℃）至-196℃溫度范圍（77K~300K）、細胞內部體相水中因分子或粒子間隨機碰撞引發(fā)的生化反應，這就為用阿倫尼烏斯二常數(shù)方程定律理解生命活動反應過程提供了便利。

       式中A為給定反應的特征常數(shù)，e為自然對數(shù)的底數(shù)（2.718），R為氣體常數(shù)（8.314 kj/mol），T為熱力學絕對溫度，單位為開(K)。

       k與T呈指數(shù)關系，溫度T的變化對速率常數(shù)k影響巨大。對于給定的化學反應，溫度升高，則k值變大，反應速率加快；反之，則反應速率減慢。這是因為，溫度升高時，反應物分子的能量增加，大量非活化分子獲得能量轉變成活化分子，體系中活化分子百分比增加后，分子間有效碰撞次數(shù)增多，反應速率相應加快。

       對生命活動過程中相關生物化學反應而言，樣品溫度低，則k值低，反應速率緩慢。將組織細胞的溫度從193K（-80℃）、123K（-150℃）降低至93K（-180℃）時，所有反應過程的反應速率依次降低直至完全停滯。為最大程度降低各種代謝、酶解、催化、應激損傷發(fā)生，提高細胞存活率和功能活性，細胞冷凍保存的溫度自然是越低越有利，選擇液氮-196℃儲存正是基于這一考慮。

       Ea為反應的活化能，可理解為由非活化分子轉變?yōu)榛罨肿舆^程對應的能量值，代表一個化學反應反應發(fā)生所需最小能量，單位是千焦耳/摩爾（kJ/mol）。Ea 位于Arrhenius公式的指數(shù)項, 因此Ea數(shù)值的改變, 對化學反應速率常數(shù)k有極大的影響。常溫條件下，Ea每改變5.7kJ /mol， k值變化將達到一個數(shù)量級 ^[6] 。Ea 的大小由反應物分子性質決定，與分子的內部結構密切相關，通常不隨溫度改變。普通化學反應的Ea一般介于40–400 kJ/mol區(qū)間。Ea小于83.14 kJ/mol的反應為快反應，Ea大于120 kJ/mol者為慢反應。人們通常研究的化學反應的活化能多數(shù)分布在80–120 kJ/?mol的范圍內 ^[7] 。

       在相同溫度下，某一化學反應過程Ea小，則反應速率常數(shù)k大，不僅代表反應速率快，還意味著反應更容易維持。而Ea大的反應進程，對活化分子濃度、溫度等條件要求高，反應速率慢。

       冷凍冷凍保存過程中細胞損傷與死亡的易發(fā)、高發(fā)現(xiàn)象足以說明，DMSO等滲透性冷凍保護劑的毒性反應、滲透壓應激、氧化應激、膜損傷等各種病理性生化反應通路激活所需的Ea，可能低于激活管家基因表達、蛋白翻譯后修飾、DNA復制增殖、細胞增殖等維持細胞正常生命活動反應通路的Ea。而低溫保存的細胞，隨著溫度升高，首先激活的生化反應必定是如帶電粒子的結合、氧自由基毒性反應這類對溫度、自由水分子需求依賴較低反應通路，其次才是諸如能量代謝、基因轉錄、蛋白翻譯與修飾等對酶活性、底物、水分子、PH環(huán)境、溫度等條件有一定要求的生化反應通路激活。因此，組織細胞長期保存溫度的選擇上，理應是以低為先，將一切易發(fā)性有害反應通路在其萌芽階段予以阻斷。

1.1 對組織細胞玻璃化轉變溫度的認識

       在冷卻溫度達到-123℃之前，樣品內部發(fā)生玻璃化轉變，因玻璃物質熱傳導性能限制，仍會有少量水、DMSO 、離子物質和代謝物等溶質存在于細胞內玻璃結構的孔隙內，Ea能值低的理化反應仍可能在胞內或在細胞外區(qū)室和細胞膜之間的局部發(fā)生。當細胞內溫度降低至玻璃化轉變溫度(Tg)以下，即低于 -123℃時，樣品內部徹底完成玻璃化轉變后，細胞內容物粘度高達10 trillion Poise，水因凝固喪失了流動性 ^[8] 。水分子擴散限制，各種生物、化學反應過程的底物傳輸、相互碰撞、分子構象改變等通通受阻，甚至連鹽離子積聚、小分子代謝物擴散都已停滯。此時，方可視為達到維持細胞功能與結構完整性所需的持久穩(wěn)定理想條件。

       體相水的玻璃化轉變溫度值及在Tg時的水分子運動已討論數(shù)十年。馬祖爾提出，體相水的玻璃化轉變溫度為-132℃ ^[9] 。而實際工作中所適用的細胞冷凍保存液，通常是在細胞培養(yǎng)基中添加CPA以及細胞抗氧自由基、抗凋亡保護性等多種組分配制的。故各種細胞保存液的玻璃化轉變溫度比純水GTTW要高，Tg介于-40℃~-125℃都有報道。

       事實上，玻璃化處理所約束的對象并不僅是溶液中的、細胞內部可流動體相水(bulk water)，還應包括生物大分子結構、細胞組分內部納米尺度孔隙中的受限水（confined water）。譬如，蛋白質結構內部間狹小的間隙中的水分子，其存在與蛋白質的結構和功能以及蛋白組裝等有關。由于水分子與界面之間的相互作用，受限水晶相的變化和相變的熱力學性質與體相水有較大的差異。分子尺度下的固液界面作用，增大水傳輸?shù)尿寗恿?，提高了水的輸運效率 ^[10] 。研究表明，納米空間尺度內的受限水，在-103℃（170K）~-73℃（200K）溫度區(qū)間發(fā)生玻璃化轉變，具體溫度取決于受限尺寸及與壁面的相互作用 ^[11] 。

       綜合來看，細胞內部體相水因含有大量溶質，特別是CPA和蛋白質，粘度高，玻璃化轉變溫度相對較高（高于-70℃）。但納米空間的受限水，其玻璃化溫度相對較低，加之溶液、細胞內容物熱傳導問題，并沒有同步完成玻璃化轉變。胞內大量納米孔隙的受限水依然處于液態(tài)，小分子化合物、粒子具有功能活性可能。以含10% DMSO的Jurkat細胞冷凍保存液為例，先以1℃/min的緩慢速率冷卻至-80℃，后再轉入液氮中保存。在冷卻過程中形成的細胞內玻璃化(intracellular glass transition, Tg'i) 結構時，觀察發(fā)現(xiàn)，水分子、離子物質等溶質仍可在玻璃態(tài)結構孔隙中遷移。當?shù)陀?-123℃時玻璃化狀態(tài)才能實現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定。這一結論不僅對Jurkat細胞有效，同樣適用于他DMSO保存時具有相似的物理特性的其它培養(yǎng)細胞系的保存處理 ^[8] 。

       因此，采用-103℃或更低的-123℃低溫環(huán)境，對于細胞內部實現(xiàn)全面持久的玻璃化轉變，有積極意義。

1.2 對生物組細胞材料低溫冷凍保存溫度的生物學考慮

       已有大量關于-70℃/-80℃的超低溫溫度環(huán)境暴露對細胞存活率、細胞功能不利影響的報道。

       譬如，關于貯藏溫度對外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）基因表達影響的研究中，PBMC被分裝成4個相同體積樣本(Sister aliquots)，一個作為新鮮組織對照，其余三個則分別在三種不同溫度條件下儲存：(1)氣相液氮中靜態(tài)儲存于?150℃，(2)模擬長期存儲中隊樣品分揀處理場景條件，在?80℃與?150℃之間循環(huán)（起始溫度?150℃；以+10℃/分鐘升溫至?80℃；保持?80℃ 10分鐘；以?30℃/分鐘降溫至?150℃；保持?150℃ 10分鐘；每日循環(huán)處理8小時持續(xù)13天；最終轉移至液氮氣相儲存）；(3)靜態(tài)?80℃超低溫冰箱儲存。

       采用 AnnV/7-AAD方法測定PBMC細胞活力的結果顯示，持續(xù)儲存在≤ ?150℃和執(zhí)行?150℃/-80℃熱循環(huán)處理的樣本間沒有差異，而?80℃下儲存樣品凋亡/壞死顯著增加。在?≤??150℃儲存的PBMC恢復率和存活率優(yōu)于?80℃儲存樣品。

       對新鮮和三種不同儲存條件下PBMC的基因表達分析，共有1367個基因表現(xiàn)出表達增加或減少超過3倍的變化。與始終保持?≤??150℃儲存的PBMC比，PBMC經(jīng)歷熱循環(huán)處理后的基因表達無顯著變化。但觀察到有18個基因表達變法只存在?80℃保存樣品組中。有66個基因分布與在2個或多個主要與應激相關細胞信號通路中，可能與氧化應激(oxidative stress)、滲透壓應激(osmotic stress)、膜損傷(membrane disruption)以及熱或冷休克(heat or cold shock)等多種應激刺激反應有關。而經(jīng)實時熒光定量PCR、微陣列相互驗證的13個基因中， 5個基因表達下調，其余8個基因表達顯著上調，被認為參與干擾素信號通路、細胞死亡相關通路、免疫調節(jié)通路及MAPK信號通路。另外，在?80℃保存的樣本中，冷凍保存30天后即可檢測到gH2AX ser139蛋白陽性，表明冷凍保存的細胞中可能發(fā)生DNA雙鏈斷裂（double-stranded breaks, DSB）和隨后激活DNA修復機制。分析DNA損傷可能與解凍后PBMC凋亡/壞死增加有關 ^[12] 。

       可用于急性肝功能衰竭治療的藻酸鹽包裹肝細胞球體（ELS），其冷凍保存儲溫度和有效保存時間，直接影響生產成本和臨床應用便利性。對分別存儲在?80℃或?170℃、儲存時間1、2、3、6、9或12個月的ELS樣品，在復溫24小時后的功能活性恢復情況評估顯示。在?170℃存儲條件下不同保存時長的ELS，存活細胞數(shù)及功能均維持在相似水平。但?80℃儲存的ELS，在短短1個月內便顯示出活力、存活細胞數(shù)及功能下降，并隨儲存時間延長觀察到逐步惡化的趨勢。存儲12個月后，?80℃環(huán)境下ELS的可存活細胞恢復率僅為?170℃存儲的15% ^[5] 。

       另一項研究發(fā)現(xiàn)，在液氮中冷凍保存的肝細胞球體的存活率與新鮮原代肝細胞球體相當，但在-80℃超低溫冰箱保存后樣品，肝功能活性明顯下降。與液氮冷凍保存組相比，將球體水凝膠微球在超低溫冰箱中冷凍保存導致氨清除率和尿素分泌率均顯著下降（約30%）。注入BAL系統(tǒng)生物反應器運行24小時后，由液氮冷凍保存的肝細胞球體，解凍后生成的水凝膠微球組的肝功能活性更高。無論冷凍保存時間多長，在液氮中保存的肝細胞球體的氨去除率或尿素分泌率均無統(tǒng)計學顯著差異。而-80℃保存的肝細胞球體的肝功能活性明顯較低，氨去除率和尿素分泌率比液氮冷凍組下降了30% ^[13] 。分析指出，組織、細胞保存時長超過1個月時，應避免使用?80℃超低溫冰箱方案。

       大量報道說明，低于-150℃的液氮儲存方案，在維持細胞功能活性、降低細胞死亡率方面極為必要。

二、從阿倫尼烏斯方程反應速度常數(shù)看細胞冷凍保存期間溫度波動問題

       對阿倫尼烏斯二元常數(shù)公式取對數(shù)后，得到公式②：

lnk = lnA-Ea/RT  ………………………………………②

       若已知反應在溫度T1、T2的速率常數(shù)分別為k1、k2，則有：

lnk_=lnA-Ea/(RT1 )   ………………………………………③

lnk2=lnA-Ea/(RT2 )  ………………………………………④

       將③、④相減得到公式⑤：

ln k1/k2 =-Ea/R(1/T1 -1/T2 )  ………………………………………⑤

       公式⑤可轉換為指數(shù)形式，得到公式⑥：

k1/k2 =e^(E_a/R((T2-T1)/(T1.T2)))  ………………………………………⑥

       根據(jù)公式⑥可知：

       對同一反應，溫度波動幅度（T1-T2）相同時，高溫區(qū)段時T1·T2值大，而k1/k2小，兩種溫度條件下反應速率接近；而低溫區(qū)段，T1·T2值小，k值增大倍數(shù)大，說明反應速率變化更顯著，既反映在此溫度區(qū)間對對溫度波動更為敏感。譬如，某一反應中，樣品溫度(T)波動是93K（-180℃）→113K（-160℃），而另一次操作溫度(T’)波動為193K（-80℃）→213K（-60℃），則根據(jù)公式⑥，得到表1計算結果。

表1 溫度波動與化學反應速率常數(shù)變化

       數(shù)據(jù)表明，樣品溫度上升幅度均為30K，高低溫間化學反應速率常數(shù)的提升倍數(shù)值K2/k1，在深低溫區(qū)高于超低溫區(qū)。假設Ea=83.14 kJ/mol，則深低溫區(qū)速率常數(shù)變化為超低溫區(qū)常數(shù)的7.4-20倍。雖然深低溫區(qū)化學反應速率整體處于低位或處于抑制狀態(tài)，但一旦達到反應活化能閾值，反應激活后會以更快加速度進行。

       表1還顯示，反應體系溫度波動幅度大，則反應速度常數(shù)提升倍數(shù)（K2/k1）大。

       為了能將氧自由基損傷、滲透壓應激等可在低溫環(huán)境下進行的生化反應遏止，應盡可地將儲存溫度保持在較低水平。同時，還應減少樣品操作管理期間高溫暴露時間，以減少樣品溫度波動幅度。

2.1 組織細胞低溫冷凍保存期間存在的溫度波動現(xiàn)象

       按國際生物與環(huán)境儲存庫學會2012年版的《研究用生物材料收集、存儲、檢索和分發(fā)存儲庫最佳實踐》指南要求，維持解凍后最好的維持細胞活性和功能，應將樣品溫度穩(wěn)定維持在?132℃以下。液氮溫度在通常實驗條件下是恒定的，故在液氮中長期存儲生物材料是目前最常用、最可靠的方法。然而，即便在現(xiàn)代生物樣本庫技術條件下，樣品轉入液氮罐、樣品儲存、樣品分類和樣品取出過程中，可能出現(xiàn)溫度波動。此外，由于存儲位置變動、物流運輸、樣本庫設施設備維護操作原因，無法確保樣品的整個生命周期內儲存在 -132℃ 以下。

       資料顯示，液氮氣相存儲裝置中的溫度波動范圍可在 -180℃至-150℃之間。緊急情況下，設備內部的溫度會上升至-130℃。據(jù)報道，常規(guī)室溫環(huán)境下，儲存在?150℃的液氮蒸氣或-150℃深低溫冰箱的樣本取出后，僅需4分鐘就樣本溫度會飆升至?132℃ ^[12] 。視室溫和樣品高溫暴露持續(xù)時間不同，將樣本重新放回液氮蒸氣或深低溫冰箱后，需數(shù)分鐘~3小時，才能讓凍存管內部恢復到取出前的儲存溫度 ^[15] 。

2.2 組織細胞冷凍保存期間溫度波動問題的負面影響

       關于生物材料長期存儲期間反復的溫度波動變化對樣品潛在損傷問題，目前還缺乏足夠系統(tǒng)的研究和數(shù)據(jù)信息。但即有資料表明，頻繁而大幅樣品溫度波動，對細胞存活率、恢復率及功能性的存在不利影響。了解這些數(shù)據(jù)，有助于為實驗室和生物庫在儲存與樣本管理方面的決策提供參考。

       德國Fraunhofer生物醫(yī)學工程研究所的研究人員通過模擬樣品管理過程中三種不同操作模式，比較了樣本存儲、樣本分選和取出過程中重復溫度波動對外周血單核細胞（PBMC）健康的影響。

       ①液氮恒溫保存模式：PBMC在液氮氣相罐中恒溫儲存（作為對照）。

       ②樣品-80℃暴露循環(huán)模式：從液氮中取出后，在-80℃保護罩內平衡約5分鐘，至樣品溫度上升至-102℃后，重新返回液氮罐中，待樣品溫度恢復至液氮保存溫度后，執(zhí)行新一輪升溫操作，共進行400次循環(huán)。

       ③樣品+20℃暴露循環(huán)模式：從液氮中取出后，在20℃室溫下平衡約5分鐘，至樣品溫度升至-60℃后重新返回液氮罐中，待樣品溫度恢復至液氮保存溫度后，執(zhí)行新一輪升溫操作，共進行400次循環(huán)。

       結果顯示，與無溫度變化的液氮恒溫儲存樣品比，周期性溫度循環(huán)波動可降低細胞活性、恢復率及針對特定抗原的免疫反應。這暗示了由樣品儲存中分揀和存取操作所引起的多次溫度變化，會降低 PBMC 的回收率和存活率（臺盼藍排斥法）以及 T 細胞功能（IFN-γ ELISpot 測定），并會增加解凍細胞培養(yǎng)過夜后死亡細胞 ^[16] 。

       另一項針對冷凍保存溫度波動對PBMC影響評估實驗，采用了三種不同儲存條件：①≤-150℃恒溫儲存模式；②先在≤-150℃下儲存24 h，后由受控升溫至-80℃，最后返回液氮中保存的三步熱循環(huán)操作，重復進行104次。總計52 小時熱循環(huán)過程中，每次在?80℃ 下維持10分鐘，104個循環(huán)的總?80℃ 暴露時長累計17.3 小時；③儲存在-80℃超低溫冰箱中。用 AnnV/7-AAD測試得到的PBMC細胞活力數(shù)據(jù)表明，液氮恒溫儲存、液氮與80℃循環(huán)處理兩種樣本間細胞存活率、基因表達變化模式基本一致。但?80℃下恒溫保存樣細胞凋亡/壞死增加。分析還指出，導致細胞損傷并非循環(huán)次數(shù)，也非從-150℃到-80℃間溫度循環(huán)或在較高溫度下暴露的累積時長，而是持續(xù)的-80℃高溫暴露所致 ^[12] 。

       低溫儲存過程中溫度波動對胎盤間充質干細胞（MSC）狀態(tài)的影響評估實驗中，將樣本從液氮冷凍儲存罐中取出，在20℃室溫下暴露，使樣品樣品溫度分別提升至-80℃、-100℃和-150℃后，立即浸入液氮恢復至-196℃，然后再提取出來進行下一輪升溫循環(huán)操作。每種測試終點溫度暴露操作各重復次數(shù)5、10、20、30、40 和 50 次后，結果顯示，與液氮恒溫儲存相比，-196℃~-100℃溫度循環(huán)進行不超過20個循環(huán)時組內MSC存活率和代謝參數(shù)屋顯著差異。但增加-196℃~-100℃溫度循環(huán)次數(shù)、-196℃~-80℃循環(huán)組的這兩個指標會顯著降低，且凋亡變化的數(shù)量會隨著溫度波動循環(huán)次數(shù)增加而增加。此外，經(jīng)歷溫度波動的樣本中，出現(xiàn)細胞解凍后的附著能力受損現(xiàn)象 ^[17] 。

       上述研究結果提示，入庫凍存樣品在分揀、提取和樣品轉運期間，應采取必要防護措施，減少較高溫度、室溫下的操作暴露次數(shù)和暴露持續(xù)時間，以確保樣品儲存安全平穩(wěn)。

（后續(xù)：從阿倫尼烏斯方程原理看組織類器官冷凍保存的解決方案-下）